Lai huỳnh quang tại chỗ là gì? Các bài nghiên cứu khoa học

Định nghĩa và nguyên lý của lai huỳnh quang tại chỗ (FISH)

Lai huỳnh quang tại chỗ (Fluorescence in situ hybridization – FISH) là kỹ thuật sinh học phân tử sử dụng các đoạn oligonucleotide hoặc DNA đánh dấu bằng huỳnh quang để nhận diện các trình tự nucleic acid đặc hiệu trong nhiễm sắc thể, tế bào hoặc mô. Mẫu vật phải được cố định và biến tính để mạch DNA tách đôi, cho phép probe lai ghép bổ sung theo nguyên tắc bắt cặp bazơ Watson-Crick. Sau đó, probe phát tín hiệu dưới ánh sáng của kính hiển vi huỳnh quang, cho phép định vị không gian chính xác của trình tự cần tìm.

Phương pháp này được phát triển từ cuối những năm 1980 và là một bước đột phá trong phân tích gen và nhiễm sắc thể. Không giống các phương pháp dựa trên PCR, FISH không yêu cầu nhân bản DNA, cho phép phân tích trực tiếp trên cấu trúc tế bào còn nguyên vẹn. Nhờ vậy, FISH có khả năng định vị các bất thường về cấu trúc hoặc số lượng của trình tự đích một cách chính xác trong môi trường tế bào học và mô học.

Nguyên lý hoạt động của FISH được mô tả như sau:

1. Biến tính DNA trong mẫu bằng nhiệt hoặc hóa chất để tách mạch đôi thành mạch đơn.
2. Thêm probe huỳnh quang đã đánh dấu có trình tự bổ sung với vùng đích.
3. Ủ lai để probe gắn đặc hiệu vào vị trí tương ứng trên DNA mục tiêu.
4. Rửa mẫu để loại bỏ probe không lai.
5. Quan sát tín hiệu huỳnh quang phát ra dưới kính hiển vi huỳnh quang chuyên dụng.

FISH có thể phát hiện các đột biến số lượng nhiễm sắc thể (aneuploidy), chuyển đoạn, mất đoạn, khuếch đại gen hoặc sự có mặt của virus trong mô ký chủ.

Các thành phần cơ bản trong kỹ thuật FISH

Thành phần đầu tiên và quan trọng nhất trong kỹ thuật FISH là probe – một đoạn DNA hoặc RNA ngắn có trình tự đặc hiệu, được gắn chất phát huỳnh quang như FITC (fluorescein), Cy3, Cy5 hoặc Alexa Fluor. Probe được thiết kế để bắt cặp với trình tự mục tiêu trên nhiễm sắc thể hoặc RNA của mẫu. Tùy ứng dụng, probe có thể là:

• Probe đặc hiệu vùng telomere, centromere hoặc locus cụ thể.
• Probe toàn bộ nhiễm sắc thể (chromosome paint).
• Probe đặc hiệu RNA (trong RNA FISH).

Mẫu vật có thể là tế bào đơn lẻ, lát cắt mô cố định, hoặc tế bào nuôi cấy được xử lý trên lam kính. Mẫu cần được xử lý để loại bỏ protein, cố định cấu trúc nhân và sau đó biến tính để các sợi DNA tách đôi, tạo điều kiện cho probe lai đặc hiệu.

Bên cạnh probe và mẫu, hệ thống FISH cần các bộ đệm chuẩn hóa độ pH và muối, thuốc nhuộm nền (DAPI hoặc Hoechst để nhuộm nhân), và thiết bị quan sát gồm kính hiển vi huỳnh quang với các bộ lọc phù hợp với bước sóng phát xạ của chất huỳnh quang.

Bảng dưới đây tổng hợp các thành phần chính:

Thành phần	Vai trò	Ví dụ
Probe	Nhận diện trình tự đích	FITC-labeled HER2 probe
Mẫu	Chứa DNA/RNA đích	Giọt tế bào metaphase, mô cố định
Bộ đệm	Ổn định môi trường lai	SSC, formamide
Kính hiển vi huỳnh quang	Phát hiện tín hiệu	Olympus BX61, Leica DM6000

Các bước thực hiện FISH

Toàn bộ quy trình FISH được thực hiện theo trình tự nghiêm ngặt để đảm bảo độ đặc hiệu và độ tái lặp. Mỗi bước đều có các yêu cầu kỹ thuật cụ thể để tối ưu hóa độ lai ghép và chất lượng hình ảnh thu được. Các bước điển hình bao gồm:

1. Chuẩn bị mẫu: Cố định tế bào hoặc mô bằng formaldehyde hoặc methanol/acetic acid. Gắn mẫu lên lam kính và sấy khô.
2. Biến tính DNA: Dùng nhiệt (70–80°C) hoặc hóa chất như formamide để tách đôi DNA.
3. Lai với probe: Thêm probe đã được đánh dấu huỳnh quang, ủ ở nhiệt độ 37–42°C từ vài giờ đến qua đêm để đảm bảo lai đặc hiệu.
4. Rửa: Dùng dung dịch chuẩn (như 2× SSC) để rửa bỏ probe không đặc hiệu.
5. Nhuộm nền: Thêm DAPI để quan sát nhân tế bào, hoặc các thuốc nhuộm nền khác nếu cần.
6. Quan sát: Dùng kính hiển vi huỳnh quang để phát hiện tín hiệu tại vị trí tương ứng của trình tự mục tiêu.

Chất lượng kết quả phụ thuộc nhiều vào độ tinh khiết của probe, điều kiện nhiệt độ và thời gian ủ, cũng như khả năng phát hiện của hệ thống kính hiển vi.

Phân loại kỹ thuật FISH

Kỹ thuật FISH không chỉ có một dạng duy nhất mà phát triển thành nhiều biến thể khác nhau để phục vụ các mục đích phân tích đa dạng. Phân loại FISH có thể dựa vào số lượng probe, loại mục tiêu (DNA hay RNA), hoặc phương pháp phát hiện tín hiệu.

Một số dạng FISH phổ biến bao gồm:

• Single-probe FISH: Dùng một loại probe duy nhất cho mục tiêu cụ thể, thường được áp dụng trong phân tích cấu trúc nhiễm sắc thể đơn lẻ.
• Multi-color FISH (M-FISH): Sử dụng nhiều probe gắn fluorochrome khác nhau để phân biệt đồng thời nhiều nhiễm sắc thể hoặc locus trong cùng một mẫu.
• RNA FISH: Áp dụng để phát hiện và định vị các phân tử RNA trong tế bào, giúp nghiên cứu biểu hiện gene ở mức độ đơn bào.
• CISH (Chromogenic in situ hybridization): Phiên bản thay thế dùng enzyme tạo màu thay vì tín hiệu huỳnh quang, phù hợp với kính hiển vi quang học thông thường.

Bảng so sánh dưới đây minh họa sự khác biệt giữa các dạng FISH:

Loại FISH	Loại mục tiêu	Cách phát hiện	Ứng dụng điển hình
Single-probe FISH	DNA	Huỳnh quang đơn	Phát hiện mất đoạn gen
M-FISH	DNA	Huỳnh quang đa màu	Phân tích toàn bộ bộ gen
RNA FISH	RNA	Huỳnh quang đơn/đa	Biểu hiện gene không gian
CISH	DNA	Chromogenic (enzyme)	Giải phẫu bệnh học lâm sàng

Xem thêm hướng dẫn kỹ thuật tại NIH – Principles of FISH

Ứng dụng trong y học và nghiên cứu

FISH là một trong những công cụ phân tử mạnh mẽ nhất hiện nay trong y học chẩn đoán và sinh học phân tử. Kỹ thuật này có thể phát hiện được nhiều loại bất thường di truyền với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, ngay cả trên mẫu mô lưu trữ hoặc mẫu tế bào hiếm. Trong lâm sàng, FISH được sử dụng rộng rãi trong các chuyên ngành như huyết học, ung thư học, di truyền học và bệnh học mô học.

Một số ứng dụng quan trọng bao gồm:

• Chẩn đoán bất thường số lượng nhiễm sắc thể: Phát hiện các hội chứng di truyền như Down (trisomy 21), Edwards (trisomy 18), Patau (trisomy 13), Turner (XO), và Klinefelter (XXY).
• Phát hiện chuyển đoạn trong ung thư: Như BCR-ABL trong bệnh bạch cầu mạn dòng tủy (CML), t(8;14) trong u lympho Burkitt, hoặc ALK trong ung thư phổi không tế bào nhỏ.
• Đánh giá khuếch đại gen: Như HER2 trong ung thư vú, EGFR trong ung thư phổi, hoặc MYCN trong u nguyên bào thần kinh.
• Phân tích biểu hiện RNA tại chỗ: RNA FISH cho phép nghiên cứu không gian biểu hiện gene tại cấp độ từng tế bào.
• Xác định vi sinh vật gây bệnh trong mô: FISH dùng probe đặc hiệu cho vi khuẩn, nấm hoặc virus, hỗ trợ chẩn đoán viêm mô, viêm phổi, hoặc ung thư có yếu tố virus.

Các hướng dẫn chẩn đoán lâm sàng như của National Cancer Institute và FDA đều khuyến nghị sử dụng FISH trong đánh giá gen HER2 để quyết định điều trị bằng trastuzumab hoặc các thuốc sinh học đích khác.

Ưu điểm của kỹ thuật FISH

FISH mang lại nhiều lợi ích so với các kỹ thuật phân tử khác, đặc biệt ở khả năng phân tích không gian trình tự gene trong bối cảnh mô học. Đặc điểm này làm FISH nổi bật trong cả nghiên cứu cơ bản và ứng dụng lâm sàng.

• Phát hiện chính xác vị trí và số bản sao của trình tự DNA trong nhân tế bào hoặc trên nhiễm sắc thể.
• Không yêu cầu bước nhân bản DNA như PCR, giảm nguy cơ sai lệch do khuếch đại.
• Phù hợp với mẫu mô lưu trữ (FFPE), có thể áp dụng trên lam mô bệnh học cũ.
• Hiển thị rõ ràng hình ảnh huỳnh quang giúp xác định bất thường trong từng tế bào cụ thể.

FISH cũng cho phép phân tích nhiều chỉ tiêu cùng lúc khi dùng đa probe, tăng cường khả năng phân tích toàn diện mà không cần chia nhỏ mẫu. Kỹ thuật này cũng tương đối dễ tích hợp vào quy trình xét nghiệm mô bệnh học hiện đại.

Hạn chế của kỹ thuật FISH

Dù mang lại nhiều ưu điểm, FISH cũng tồn tại một số hạn chế kỹ thuật và kinh tế. Một số yếu tố có thể ảnh hưởng đến độ chính xác, độ lặp lại hoặc tính khả thi của phương pháp trong thực hành.

• Chi phí cao do giá probe huỳnh quang và yêu cầu thiết bị kính hiển vi chuyên biệt.
• Không phát hiện được các đột biến điểm nhỏ hoặc thay đổi trình tự nhỏ (<10 bp).
• Thời gian thực hiện lâu hơn so với PCR do cần bước lai qua đêm và xử lý hình ảnh phức tạp.
• Cần kỹ thuật viên được đào tạo bài bản để phân tích và đọc tín hiệu chính xác.

FISH cũng có giới hạn về độ phân giải (thường từ 100 kb đến vài Mb), do đó không thay thế được cho các phương pháp có độ phân giải cao hơn như giải trình tự thế hệ mới (NGS) hoặc array-CGH trong một số ứng dụng chuyên sâu.

So sánh FISH với các kỹ thuật khác

Việc lựa chọn kỹ thuật phân tích phù hợp phụ thuộc vào mục tiêu chẩn đoán hoặc nghiên cứu. Bảng dưới đây so sánh các đặc điểm chính giữa FISH, PCR và NGS:

Tiêu chí	FISH	PCR	NGS
Vị trí không gian trên mô	Có	Không	Không
Phát hiện đột biến điểm	Không	Có	Có
Phân tích toàn bộ bộ gen	Hạn chế	Không	Có
Chi phí	Trung bình đến cao	Thấp	Rất cao
Yêu cầu thiết bị phức tạp	Vừa	Thấp	Rất cao

FISH nổi bật khi cần đánh giá cấu trúc nhiễm sắc thể hoặc định vị gene trên lát cắt mô, trong khi PCR và NGS thích hợp hơn cho phân tích trình tự nhỏ hoặc biến đổi phân tử sâu hơn.

Xu hướng phát triển và tích hợp công nghệ

FISH đang bước vào giai đoạn phát triển thế hệ mới, trong đó tích hợp công nghệ tự động hóa, giải pháp phân tích hình ảnh bằng AI, và lai với các kỹ thuật siêu phân giải. Một trong những công nghệ tiên tiến là MERFISH (Multiplexed Error-Robust FISH), cho phép theo dõi hàng nghìn phân tử RNA cùng lúc với độ phân giải từng phân tử.

Bên cạnh đó, các hệ thống high-throughput như SeqFISH, smFISH, và Hybridization Chain Reaction (HCR) được ứng dụng trong nghiên cứu biểu hiện gene ở cấp độ tế bào đơn, tăng cường khả năng định lượng và tái tạo cấu trúc tổ chức mô 3D.

Các hệ thống thương mại như BioView, MetaSystems, hoặc Leica Bond đang được triển khai trong các trung tâm chẩn đoán để tự động hóa phân tích FISH trên quy mô lớn, giảm sai sót và tăng hiệu suất.

Xem thêm về các cải tiến FISH tại Nature Methods – MERFISH Technology

Tài liệu tham khảo

1. Levsky JM, Singer RH. (2003). “Fluorescence in situ hybridization: past, present and future.” Journal of Cell Science, 116, 2833–2838.
2. Raj A, et al. (2008). “Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.” Nature Methods, 5, 877–879.
3. NIH – Basic Principles of FISH
4. National Cancer Institute – FISH in Cancer Diagnosis
5. Nature Methods – MERFISH Technology